Variant calling 过程的文件格式

这篇笔记整理了在做基因组注释与变异检测时，底层文件格式的含义。
主要覆盖参考基因组构建（BWA 索引、功能注释）、Fastq 原始测序数据、以及 VCF 变异结果文件中的关键字段。

参考基因组

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151

tree ../Sus_scrofa/Ensembl_V111/ ../Sus_scrofa/Ensembl_V111/ ├── 01_Build_Genome_DB.sh ├── 02_raw │   ├── Sus_scrofa.Sscrofa11.1.111.gff3 │   └── Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna_sm.toplevel.fa ├── 03_genome │   ├── cds.fa.gz │   ├── gene.fa.gz │   ├── genome.dict │   ├── genome.fa │   ├── genome.fa.amb │   ├── genome.fa.ann │   ├── genome.fa.bwt │   ├── genome.fa.fai │   ├── genome.fa.index │   ├── genome.fa.pac │   ├── genome.fa.sa │   ├── genome.gff │   ├── mrna.fa.gz │   ├── pep.fa.gz │   ├── promoter_3kb.fa.gz │   ├── Ref │   │   ├── genome.fa │   │   ├── id_table.txt │   │   ├── ref.genome.dict │   │   ├── ref.genome.fa │   │   ├── ref.genome.fa.amb │   │   ├── ref.genome.fa.ann │   │   ├── ref.genome.fa.bwt │   │   ├── ref.genome.fa.fai │   │   ├── ref.genome.fa.len │   │   ├── ref.genome.fa.pac │   │   ├── ref.genome.fa.sa │   │   └── ref.genome.gff │   └── stat │   ├── biological_region │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── gene@c_gene_segment │   │   ├── name │   │   │   └── name_exon.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── gene@j_gene_segment │   │   ├── name │   │   │   └── name_exon.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── gene@mrna │   │   ├── description │   │   │   └── description_gene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_gene.txt │   │   │   └── name_mrna.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── gene@rna │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_gene.txt │   │   │   └── name_rna.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── gene@v_gene_segment │   │   ├── description │   │   │   └── description_gene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_gene.txt │   │   │   └── name_v_gene_segment.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── ncrna_gene@lnc_rna │   │   ├── description │   │   │   └── description_ncrna_gene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_lnc_rna.txt │   │   │   └── name_ncrna_gene.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── ncrna_gene@mirna │   │   ├── description │   │   │   └── description_ncrna_gene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_mirna.txt │   │   │   └── name_ncrna_gene.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── ncrna_gene@rrna │   │   ├── description │   │   │   └── description_ncrna_gene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_ncrna_gene.txt │   │   │   └── name_rrna.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── ncrna_gene@scrna │   │   ├── description │   │   │   └── description_ncrna_gene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_ncrna_gene.txt │   │   │   └── name_scrna.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── ncrna_gene@snorna │   │   ├── description │   │   │   └── description_ncrna_gene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_ncrna_gene.txt │   │   │   └── name_snorna.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── ncrna_gene@snrna │   │   ├── description │   │   │   └── description_ncrna_gene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_ncrna_gene.txt │   │   │   └── name_snrna.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── ncrna_gene@transcript │   │   ├── description │   │   │   └── description_ncrna_gene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_ncrna_gene.txt │   │   │   └── name_transcript.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── ncrna_gene@trna │   │   ├── name │   │   │   └── name_exon.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── pseudogene@pseudogenic_transcript │   │   ├── description │   │   │   └── description_pseudogene.txt │   │   ├── name │   │   │   ├── name_exon.txt │   │   │   ├── name_pseudogene.txt │   │   │   └── name_pseudogenic_transcript.txt │   │   └── table_per_feature_type.txt │   ├── region │   │   └── table_per_feature_type.txt │   └── stat_features.txt ├── 04_diamond │   ├── cds.diamond_blastx.go.txt │   ├── cds.diamond_blastx.kegg.txt │   ├── cds.diamond_blastx.nr.txt │   ├── mRNA2gene.txt │   └── tmp ├── 05_annotation │   ├── GO.annotation.txt │   ├── KEGG.annotation.txt │   └── NR.annotation.txt └── nohup.out

• 01_Build_Genome_DB.sh: 核心构建脚本。包含从原始数据下载、过滤、索引构建到功能提取的全流程命令。
• nohup.out: 记录脚本运行过程中的标准输出与错误日志，用于追溯构建过程中的异常。
• 02_raw: 存储从公共数据库（如 Ensembl）下载的原始未处理文件。
  • .gff3: 原始基因组注释。
  • .dna_sm.toplevel.fa: 软掩盖（Soft-masked）的基因组序列，重复序列被标记为小写字母。
• 03_genome：存储处理后的序列及各类访问索引。
  • *.fa.gz (cds, gene, mrna, pep, promoter): 提取出的各类功能元件序列包。
  • genome.fa / genome.gff: 经过标准化处理（如重命名染色体）的主参考文件。
  • BWA 索引 (.amb, .ann, .bwt, .pac, .sa): 用于二代测序数据比对。
  • 访问索引 (.fai, .dict): 用于随机定位与校验。
  • Ref/：
    • ref.genome.*: 该子目录下文件通常为 downstream 流程（如 GATK）专用。
    • id_table.txt: 关键对照表，记录原始染色体 ID 到标准化 ID 的映射。
  • stat/：
    • gene@mrna/ / ncrna_gene@lnc_rna/ 等: 按“父特征@子特征”命名的分类统计。
      • name/: 包含 ID 与基因/转录本名称的映射（name_gene.txt 等）。
      • description/: 存储基因的功能描述信息，用于注释补全。
      • table_per_feature_type.txt: 该类特征的数量、平均长度等统计报表。
    • stat_features.txt: 整个基因组所有特征类型的总览统计。
• 04_diamond：使用 DIAMOND 工具将提取的 CDS/mRNA 序列与蛋白库进行比对。
  • • *.go.txt / *.kegg.txt / *.nr.txt: 初始比对结果，记录了查询序列与数据库序列的相似性得分（E-value, Identity）。
  • mRNA2gene.txt: 关系映射表，用于将比对到的转录本功能归类到所属基因上。
• 05_annotation：将比对结果经过滤、去重、权重筛选后生成的最终注释表。
  • GO.annotation.txt: 基因与 Gene Ontology 词条的对应关系。
  • KEGG.annotation.txt: 基因与代谢通路（Pathways）的对应关系。
  • NR.annotation.txt: 基因与已知蛋白功能的详细文本描述对照表。

测序原始文件

原始数据质控

fastp质控输出

*_CleanData_R1.fastq.gz & *_CleanData_R2.fastq.gz
fastp统计 json/html
整合所有样本的报告 data_stat.txt

fastQC质控报告

对 CleanData 进行，输出zip/html报告。

序列访问索引

这类索引用于实现对大型 FASTA 文件的随机访问（Random Access），使软件能够快速定位并提取特定染色体或位置的碱基。

samtools索引

samtools faidx ref.genome.fa
该指令会生成genome.fa.fai。

注：某些性染色体（如 Y 染色体）或部分高度重复区域的组装结果可能比某些长 Scaffold 还要短。仅凭长度排序sort -k2nr是一种启发式搜索，不能作为最终证据。建议结合第一列的 NAME 命名规范进行二次判定。

基于BWA的比对索引

bwa index -a bwtsw ref.genome.fa
通常不需要关注这些文件结构。

扩展名	格式/内容解释
.bwt	Burrows-Wheeler Transform：核心索引，将序列转换为数学表示。
.ann	Annotation：记录染色体 ID、长度及在 .pac 中的连接顺序。
.amb	Ambiguous：记录非 ATGC 碱基（如 N）的位置。
.pac	Packed：二进制。将原始碱基以 2-bit 形式压缩存储。
.sa	Suffix Array：后缀数组采样点，用于坐标还原。

.amb:

# 头部行（第一行）：参考基因组的总长度，参考序列的数量（染色体或 Contig 的总数），内部校验值或特定格式标记
# N区域起始位置，N区域长度，N区域所在的序列名或索引（通常与.ann文件对应）
2501912388 613 544
90927422 100 n
91945429 100 n
92881119 100 n
214753360 100 n
......

.ann:

# 头部行（第一行）：参考基因组的总长度，参考序列的数量（染色体或 Contig 的总数），内部校验值或特定格式标记
# 序列注释块两行为一组：第一行分别为，该序列在整个连接参考序列中的起始偏移量（Offset），序列名称，该序列的描述信息。
# 第二行分别为， 内部标记（通常标明该序列在链接过程中的某些状态），该序列的精确长度，该序列包含的非变体或特定字符（如N）的数量类别标识。
2501912388 613 11
0 1 (null)
0 274330532 4
0 2 (null)
274330532 151935994 6
0 3 (null)
426266526 132848913 10
0 4 (null)
559115439 130910915 5
0 5 (null)
......

picard索引

$java -Xmx$picard_mem -jar $picard CreateSequenceDictionary R=$ref_db O=$dict && touch $DONE/picard_index.done
生成ref.genome.dict:

.dict 文件由两部分组成：

• @HD (Header Line)：定义文件版本和排序方式。
• @SQ (Sequence Dictionary Line)：定义参考基因组中每一条染色体或 Contig 的具体信息。

每列意义：

标签 (Tag)	名称	意义	示例/备注
@HD	Header	文件的头部起始标志	表明这是一个头部行
VN	Version	格式版本号	1.5
@SQ	Sequence	序列记录起始标志	每一行代表一条染色体或 Contig
SN	Sequence Name	序列名称	如 1, 2, X 或 Contig ID FPKY02000001.1
LN	Length	序列长度	单位为碱基对 (bp)。例如染色体 1 长度为 274330532
M5	MD5 Checksum	序列内容的 MD5 校验码	用于唯一标识序列内容，防止因文件名相同但内容不同导致的错误
UR	URI	参考基因组源文件的路径	指向原始 .fa 文件的位置，通常为绝对或相对路径

比对过程文件

*.bam

sam文件的压缩二进制表示：

Header 头部信息：以 SAM 文本格式存储的元数据，包含版本、序列字典（@SQ）、读段分组（@RG）和比对工具（@PG）。在 BAM 中，这部分被转换为二进制存储。

Alignments比对部分：

列号	字段名称	含义说明	示例/取值范围
1	QNAME	序列 ID (Query Name)	来自测序仪的原始 ID
2	FLAG	数字标识 (Bitwise Flag)	代表比对状态的位运算总和
3	RNAME	参考序列名称 (Reference Name)	染色体编号，若未比对上则为 *
4	POS	比对起始位置 (Position)	基于 1 的最左端位置
5	MAPQ	比对质量值 (Mapping Quality)	比对结果错误的概率（−10log10​P）
6	CIGAR	简并比对表示法	描述 Match、Mismatch 及 Indel
7	RNEXT	配对端比对到的染色体	=  表示与本 Read 相同，* 表示无配对
8	PNEXT	配对端比对到的位置	配对 Read 的起始位置
9	TLEN	观察到的片段长度 (Template Length)	插入片段大小，通常左端为正，右端为负
10	SEQ	Read 的碱基序列	A, T, C, G, N
11	QUAL	碱基质量得分 (Phred Quality)	ASCII 编码的碱基准确性信息

FLAG

FLAG 列通过一个十进制数字存储了多个布尔状态（True/False）。它是通过将以下二进制位累加得到的。

常用标志位（部分）：

• 1 (0x1): 该 Read 是双端测序（Paired-end）。
• 2 (0x2): 该 Read 每一端都正确比对上（Properly aligned）。
• 4 (0x4): 该 Read 未比对上（Unmapped）。
• 16 (0x10): 该 Read 比对到了负链（Reverse strand）。
• 256 (0x100): 二次比对（Secondary alignment）。
• 1024 (0x400): 重复记录（PCR or Optical Duplicate）。

例：FLAG 为 99，其二进制分解为 64+32+2+1：

• 1: 双端测序
• 2: 正确匹配
• 32: 配对端在负链
• 64: 这是双端中的第一条 Read (R1)
• (蕴含信息：本条 Read 在正链)

MAPQ：比对质量

MAPQ 是评估比对结果“唯一性”的关键指标，计算公式为：

MAPQ=$−10log_{10}​P(mapping\ is\ wrong)$

• 40 - 60: 高置信度，Read 极大概率只属于当前位置。
• 0: 极低置信度。通常表示 Read 序列过于简单（如全 A）或在基因组中存在多个几乎相同的拷贝，软件无法确定其真实位置。

CIGAR：比对状态描述

CIGAR 字符串告诉我们 Read 是如何“贴”在参考序列上的：

• M: Alignment Match (可以是 Mismatch，仅表示比对位置对齐)。
• I: Insertion (相对于参考基因组，Read 多出了碱基)。
• D: Deletion (相对于参考基因组，Read 缺失了碱基)。
• S: Soft Clipping (末端未比对上的部分，但在记录中保留了碱基序列)。
• H: Hard Clipping (末端未比对上的部分，且在记录中删除了该段序列)。

可选标签 (Optional Tags)

在 11 列之后，通常会有形如 NM:i:1 或 MD:Z:100 的标记。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

AS:i 匹配的得分 XS:i 第二好的匹配的得分 YS:i mate 序列匹配的得分 XN:i 在参考序列上模糊碱基的个数 XM:i 错配的个数 XO:i gap open的个数 XG:i gap 延伸的个数 NM:i 经过编辑的序列 YF:i 说明为什么这个序列被过滤的字符串 YT:Z 值为UU表示不是pair中一部分(单末端？)、CP(是pair且可以完美匹配) DP(是pair但不能很好的匹配)、UP(是pair但是无法比对到参考序列上) MD:Z 代表序列和参考序列错配的字符串

异常检测建议

观察到某行的数据不符合上述逻辑，可以采用以下排查思路：

1. 若 FLAG 包含 4（未比对）：则 POS 必须为 0，CIGAR 必须为 *。若不符，说明文件在生成过程中可能存在逻辑错误或软件 Bug。
2. 若 TLEN 远大于文库长度：可能存在染色体结构变异（SV），或者该 Read 的两端被错误地比对到了相隔极远的位置。
3. 线性对齐：一条read比对到参考序列上，可以存在插入(insert)、缺失(delete)、跳跃(skip)、剪切(clip)，但是方向不变（不能是一部分和正链匹配，另一部分又和负链匹配），sam文件中只占用一行记录。
4. 嵌合比对：由于一条测序read比对到基因组上时分别比对到两个不同的区域，而这两个区域基本没有接触和重叠。因此它在sam文件中需要占用多行记录显示。只有第一个记录称作”representative”,其他的都是”supplementary”。RNA-seq中的chimeric read或许可以说明有融合基因存在，但在基因组中一般作为结构变异的证据。

*.sort.bam

比对并按坐标排序后的二进制文件。

Picard MarkDuplicates

*.rmdup.bam

经过 Picard (CPU) 或 Parabricks (GPU) 处理，标记了 PCR/Optical 重复后的文件。

FLAG 标签

普通 BAM 文件中的 Read 通常没有关于重复的信息。而在 rmdup.bam 中，被识别为重复的 Read，其 FLAG 列数值会增加 1024 (0x400)。

• 普通比对 Read (R1, 正向比对): FLAG = 99

• 标记为重复后的相同 Read: FLAG = 1123 (99+1024)

“标记”与“删除”的策略差异

根据运行参数 REMOVE_DUPLICATES 的不同，结果有两种表现：

• 默认 (False)：保留所有 Read，仅通过 FLAG 位进行标记。下游工具（如 GATK HaplotypeCaller）会识别此 FLAG 并主动忽略这些数据。

• 删除 (True)：物理删除被识别为重复的 Read。此时文件体积会显著减小，但该操作不可逆，通常不建议在临床或高标准研究中使用。

坐标排序要求

MarkDuplicates 运行前要求 BAM 文件必须按坐标（Coordinate）或查询名（Queryname）排序，因此 rmdup.bam通常继承了严格的排序属性。

*.metrics

.metrics 文件是一个以制表符分隔（Tab-delimited）的文本文件，记录了文库的复杂度和重复率统计信息。它通常分为三个主要部分：

命令行信息 (Header)

包含运行 Picard 的版本、具体参数设置以及处理时间。

核心指标表 (METRICS CLASS)

这是分析的核心，定义了文库的质量特征。

字段名称	含义
LIBRARY	文库名称（来源于 BAM 头的 @RG 标签）。
UNPAIRED_READS_EXAMINED	检查的单端 Read 总数。
READ_PAIRS_EXAMINED	检查的双端 Read 对总数。
SECONDARY_OR_SUPPLEMENTARY_RDS	次要或补充比对的 Read 数量。
UNMAPPED_READS	未比对上的 Read 数量。
UNPAIRED_READ_DUPLICATES	标记为重复的单端 Read 数量。
READ_PAIR_DUPLICATES	标记为重复的双端 Read 对数量。
PERCENT_DUPLICATION	重复率。计算公式为：Duplicates/Examined Reads。
ESTIMATED_LIBRARY_SIZE	预估文库规模。基于现有数据推测出的文库中唯一分子的近似总数。

直方图数据

如果设置了相关参数，文件末尾会包含一组数据，用于描述随着测序深度的增加，发现新（唯一）分子的效率。常用于判断继续增加测序量是否还有意义。

如何解读高重复率？

当 .metrics 显示 PERCENT_DUPLICATION 过高（例如 > 20%）时，应考虑以下替代假说并寻找诊断性证据：

假说 A：测序量过度（Over-sequencing）

解释：文库本身的分子种类有限，但测序深度过高，导致同一个分子被反复测序。

诊断性证据：ESTIMATED_LIBRARY_SIZE 远小于总测序量。增加测序量后，重复率线性上升。

假说 B：起始 DNA 量不足或文库复杂度低

解释：实验起始的 DNA 模板太少，PCR 扩增次数过多以补偿浓度。

诊断性证据：即使总 Read 数不多，重复率依然很高；且 ESTIMATED_LIBRARY_SIZE 的绝对数值较低。

假说 C：光学重复（Optical Duplicates）

解释：测序仪拍照或信号聚类过程中的技术偏差。

诊断性证据：查看 READ_PAIR_OPTICAL_DUPLICATES 字段。若该值比例异常高，通常与测序芯片（Flowcell）载量或聚类算法有关。

比对后统计文件

Picard CollectInsertSizeMetrics

*.InsertSizeMetrics.txt

记录插入片段均值与标准差。

## htsjdk.samtools.metrics.StringHeader
# CollectInsertSizeMetrics HISTOGRAM_FILE=../Output/InsertSize_result/Sample_1/Sample_1.InsertSizePlot.pdf INPUT=../Output/Sample_1/Sample_1.rmdup.bam OUTPUT=../Output/InsertSize_result/Sample_1/Sample_1.InsertSizeMetrics.txt VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT    DEVIATIONS=10.0 MINIMUM_PCT=0.05 METRIC_ACCUMULATION_LEVEL=[ALL_READS] INCLUDE_DUPLICATES=false ASSUME_SORTED=true STOP_AFTER=0 VERBOSITY=INFO QUIET=false COMPRESSION_LEVEL=5 MAX_RECORDS_IN_RAM=500000 CREATE_INDEX=false CREATE_MD5_FILE=false GA4GH_CLIENT_SECRETS=client_secrets.json USE_JDK_DEFLATER=false USE_JDK_INFLATER=false
## htsjdk.samtools.metrics.StringHeader
# Started on: Thu Jan 22 12:37:09 UTC 2026

## METRICS CLASS        picard.analysis.InsertSizeMetrics
MEDIAN_INSERT_SIZE      MODE_INSERT_SIZE        MEDIAN_ABSOLUTE_DEVIATION       MIN_INSERT_SIZE MAX_INSERT_SIZE MEAN_INSERT_SIZE        STANDARD_DEVIATION      R
EAD_PAIRS      PAIR_ORIENTATION        WIDTH_OF_10_PERCENT     WIDTH_OF_20_PERCENT     WIDTH_OF_30_PERCENT     WIDTH_OF_40_PERCENT     WIDTH_OF_50_PERCENT     WI
DTH_OF_60_PERCENT     WIDTH_OF_70_PERCENT     WIDTH_OF_80_PERCENT     WIDTH_OF_90_PERCENT     WIDTH_OF_95_PERCENT     WIDTH_OF_99_PERCENT     SAMPLE  LIBRARY REA
D_GROUP
293     289     42      2       267253735       296.417202      73.607692       79130765        FR      17      33      49      67      85      109     135     1
73     235     303     583

## HISTOGRAM    java.lang.Integer
insert_size     All_Reads.fr_count
2       226
3       224
4       287
5       268
......

*.InsertSizePlot.pdf

• 诊断假说: 若分布非单峰正态，可能是 DNA 片段化不均或磁珠筛选失效。

  samtools flagstat

  输出每个样本的比对统计。

  *_aln_stat.txt

  186234779 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
  0 + 0 secondary
  1688865 + 0 supplementary
  21718577 + 0 duplicates
  185728377 + 0 mapped (99.73% : N/A)
  184545914 + 0 paired in sequencing
  92272957 + 0 read1
  92272957 + 0 read2
  177551800 + 0 properly paired (96.21% : N/A)
  183900400 + 0 with itself and mate mapped
  139112 + 0 singletons (0.08% : N/A)
  3380244 + 0 with mate mapped to a different chr
  2409003 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)
  

• *.flagstat: 比对率统计（Mapped, Properly paired, Singleton）。

• *.depth: 碱基水平的深度文件。由 samtools depth 生成，是 depth_stat.pl 计算覆盖度的基础。

BAM 索引与整体对齐统计汇总

*.bai

BAM 索引文件，允许 IGV 等软件快速查看特定位点。

变异检测过程文件

*.realign.bam

UnifiedGenotyper 模式下经过 InDel 局部重比对，消除 InDel 末端比对错位造成伪 SNP 的干扰。

Variant calling结果文件

VCF:

字段名	格式/内容解释
CHROM	变异所在的染色体 ID（如“1”、“chrX”）
POS	变异在染色体上的物理位置（从 1 开始，单位为 bp）
ID	变异的唯一标识符（如 dbSNP 编号“rsID”；若无则为“.”）
REF	参考基因组的碱基（或序列），即未发生变异时的等位基因
ALT	变异等位基因（Alternative），与 REF 不同的碱基（或序列）；多等位用逗号分隔
QUAL	变异位点的质量分数（Phred Scale），表示对该变异存在的置信度，值越高越可靠
FILTER	过滤结果，“PASS” 表示通过所有标准，其他为未通过的过滤标签或原因
INFO	逗号分隔的附加注释信息，如变异类型（SNP/INDEL）、功能注释、等位基因频率、深度等参数；具体内容取决于分析流程
FORMAT	后续样本信息格式。描述每个样本的字段顺序与类型（如 GT:DP 表示基型和测序深度）
SAMPLE1	按 FORMAT 顺序展示该样本的各项指标（如“0/1:26”，分别表示基因型0/1和深度26）
SAMPLE2	同上，代表下一个样本的数据

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INFO列详细解读

从“变异检测（Calling）”到“质量过滤（Filtering）”再到“功能注释（Annotation）”，每个阶段产生的 VCF，其 INFO 列的侧重点存在显著的诊断性差异。

原始检测阶段 (Raw Variant Calling)

目标：评估变异信号是否真实存在，排查测序噪声（Artifacts）。

产生的 VCF：单样本 VCF 或 gVCF（Genomic VCF）。

INFO 核心关注点：测序深度分布、碱基质量偏差、链偏好性。

联合分型与群体评估阶段 (Joint Calling & Population Stats)

目标：在群体层面评估等位基因频率，通过群体特征修正个体位点的置信度。

产生的 VCF：多样本（Multisample）VCF。

INFO 核心关注点：等位基因计数（AC）、频率（AF）、群体层面的质量指标。

功能过滤与临床/育种注释阶段 (Filtering & Annotation)

目标：判定变异的生物学效应及其与表型的关联。

产生的 VCF：过滤后的 VCF、注释后的 VCF（Annotated VCF）。

INFO 核心关注点：基因组位置（内含子/外显子）、氨基酸改变、有害性预测分值。

• INFO 字段分类解析

• 测序与比对质量指标（用于 Hard Filtering）

这些指标是区分真实变异与测序/比对误差的关键诊断依据。

字段	全称	诊断意义（贝叶斯视角下的排他性证据）
QD	QualByDepth	变异置信度与深度的比值。若 QD 过低，说明高质量碱基支撑不足，可能是由重复序列区域的比对错误引起的。
FS	FisherStrand	Fisher 链偏好性评分。若值过高（>60），说明变异仅出现在正向链或反向链中，高度疑似测序偏好造成的假阳性。
SOR	StrandOddsRatio	另一种衡量链偏好性的指标，尤其在深度较高时比 FS 更稳健。
MQ	RMSMappingQuality	比对质量均方根。若 MQ < 40，说明支持该变异的 Read 大多来自比对不明确的区域（如转座子、重复序列）。
MQRankSum	MQ Rank Sum	比较参考基因组 Read 与变异 Read 的比对质量差异。若差异显著，说明变异 Read 可能源自错配。

• 群体遗传学指标（用于群体研究/GWAS）

当样本量增加时，这些指标可作为评估位点多态性的证据。

字段

全称

说明

AC	Allele Count	该位点 ALT（变异）等位基因在当前群体中出现的总次数。
AN	Allele Number	该位点所有有效样本（非缺失）中等位基因的总数（二倍体通常为 2× 样本数）。
AF	Allele Frequency	等位基因频率 (AF=AC/AN)。在罕见疾病分析中，AF > 1% 通常被视为中性变异的排除证据。

• 功能注释指标（由 SnpEff/VEP 等工具添加）

这是将技术数据转化为业务结论的关键字段。

字段	说明	示例内容
ANN / CSQ	功能预测 (Consequence)	记录变异对蛋白质的影响：missense_variant (错义), synonymous_variant (同义), stop_gained (提前终止)。
LOF	功能缺失 (Loss of Function)	标识变异是否导致基因功能丧失。在育种中，这是筛选关键控制基因的核心证据。
NMD	无义介导降解	预测转录本是否会因为提前终止密码子而被细胞机制降解。

• 特殊格式：gVCF 里的 INFO 差异

如果运行的是 HaplotypeCaller 的 -ERC GVCF 模式,

• END 字段：由于 gVCF 会记录“非变异区域（Non-variant blocks）”，END 表示该块状区域（Block）的结束位置。

• 逻辑变化：在 gVCF 阶段，INFO 并不提供复杂的变异指标，而是记录该区域作为“纯合参考”的置信度。这是为了在后续多样本 GenotypeGVCFs 阶段提供先验概率。

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其它字段的理解

• QUAL 为 . 是什么意思？

• QUAL 是位点层面的质量值（Phred），但在不少场景会缺失并写成 .，常见原因包括：

• 该 VCF 来自联合分型/二次处理流程，作者选择不输出或无法定义统一的 site-level QUAL；

• 该记录不是标准“变异位点”的评分（例如某些 gVCF 的非变异记录/中间格式转换）。

• 实战中更常用的是 FILTER、INFO（如 QD/FS/MQ）和样本级 FORMAT（如 GQ/DP/AD/PL）综合判断。

• FORMAT 常见会有哪些字段？怎么和每个 SAMPLE 对上？

• FORMAT 用冒号把“样本列里每一段的含义”写清楚，样本列按同样的冒号顺序给出值。

• 常见 FORMAT 子字段（不同 caller/流程会略有差异）：

• GT：基因型（genotype），最关键。

• DP：该样本在该位点的测序深度（depth）。

• AD：allelic depth，常见为 REF,ALT1,ALT2... 的计数，例如 AD=10,3 表示 REF 支持 10、ALT1 支持 3。

• GQ：genotype quality（Phred），表示该样本基因型判定的置信度。

• PL：phred-scaled likelihoods，基因型似然（通常是一串逗号分隔的整数，用于下游再推断）。

• PS：phase set（相位集合 ID），配合 GT 中的 | 使用（不是所有 VCF 都有）。

• 例子：若 FORMAT=GT:AD:DP:GQ，则样本列形如 0/1:10,3:13:45，逐段对应 GT=0/1、AD=10,3、DP=13、GQ=45。

• GT 里的 1/2、0|1、1|0、1|1 怎么读？

• GT 的数字是对 REF/ALT 的索引编号：

• 0 表示 REF

• 1 表示 ALT 列里第 1 个等位基因

• 2 表示 ALT 列里第 2 个等位基因（如果 ALT 是多等位，比如 ALT=AT,CT）

• ` / ` vs `

  `：

• 0/1：未定相（unphased）的杂合，表示两个染色体拷贝分别为 REF 和 ALT1，但不知道哪条单倍型上是哪一个。

• 0|1：已定相（phased），表示这两份等位基因的相位已知（哪条单倍型是 0，哪条是 1）。

• 常见组合的直觉：

• 0/0：纯合参考（无变异）。

• 0/1：杂合（一个 REF、一个 ALT1）。

• 1/1：纯合 ALT1（两个拷贝都是第 1 个 ALT）。

• 1/2：多等位杂合（一个拷贝是 ALT1、另一个拷贝是 ALT2；要求 ALT 至少有两个备选等位基因）。

• 0|1 vs 1|0：两者都表示杂合且已定相，但哪条单倍型携带 ALT 不同；如果下游做连锁/单倍型分析，这个方向信息会影响结果。