上机测序

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记录了二代测序的原理。

常见测序方法

  • Illumina SBS：边合成边测序技术，桥式PCR扩增文库，读长通常在100-300bp之间。
      • 优势： 成本低、通量高、准确率高（>99.9%）。
  • 应用： 适用于检测SNP（单核苷酸多态性）、小片段Indel（插入/缺失）、CNV（拷贝数变异）等。
    • 代表仪器： Illumina NovaSeq, HiSeq, NextSeq系列。
  • 第三代长度长测序
    • PacBio SMRT：单分子实时测序，
    • Oxford Nanopore Technologies (ONT)：纳米孔测序，直接读取单分子DNA，通过纳米孔检测电流变化。
    • 优势： 读长长（可达kb至Mb级别），适合解决复杂区域（如高重复序列、SV结构性变异、单倍型分析）。

桥式扩增

  • 待测DNA片段固定在流动槽的探针上。
  • 开启桥式扩增第一个循环

  • 扩增至N个循环
  • 仅保留forward/reverse链。
  • 边合成边测序：使用的是带有可逆阻断基团的 dNTP（不同于 ddNTP）。其 3’ 端被一个可以化学切除的基团保护。 这种阻断是暂时且可逆的。每轮循环加入一个碱基并拍照后，通过化学试剂切除阻断基团，使 3’ 端恢复羟基，从而继续下一轮合成。

乳液PCR

Roche454，SOLiD，Ion Torrent都是这类。 DNA片段与dNTP、引物和聚合酶包在一个油滴中，独立进行PCR扩增。 优势：

  • 每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，能大大降低相互间的干扰和测序偏差
  • 测序读长，平均读长可达400bp，最长可达800bp 劣势：
  • 无法准确测量同聚物长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，可能导致结果不准
  • 测序成本相对较高

    ABI Solid 边连接边测序

    连接酶测序

    1. 8碱基单链荧光探针混合物与单链DNA模板链配对完成，发出代表第1,2位碱基的荧光信号，然后在5和第6位碱基之间进行切割，移除荧光信号，即第一轮测序获得第1、2位，第二次是第6、7位……在测到末尾，将新合成的链变性洗脱掉
    2. 接着用引物n-1进行第二轮测序，发出代表第0,1位碱基的荧光信号，然后在5和第6位碱基之间进行切割，移除荧光信号，即第二轮测序获得第0、1位，第二次是第5、6位……在测到末尾，将新合成的链变性洗脱掉
    3. 依此类推，用n-2,n-3,n-4继续测序（接入长度为5bp的特殊探针bridge probe），五轮测序后即完成所有位置的碱基测序，且每个位置的碱基均被检测了两次 优势：
  • 每个碱基为双次检测，原始测序准确性高达99.94%，而15x覆盖率的准确性更是达到了99.999% 劣势：
  • 读长短（2×50bp），后续序列拼接比较复杂
  • 鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，荧光解码阶段，一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误

半导体测序

ION芯片测序

  1. 将处理好的磁珠固定在高密度半导体芯片的小孔中，与Roche454技术类似，一个小孔即为一个反应池
  2. 依次加入4种dNTP，配对成功后会释放出一个氢离子，反应池中PH发生改变
  3. 微电极检测PH变化，检测到的H+离子信号转化为数字信号，从而读出DNA序列
  4. 洗脱后进入下一轮碱基测序 优势：
    • 将化学信号转换为数字信号，不需要昂贵的物理成像等设备，成本低、操作简单、速度快
    • 同聚物准确测量得到改善，DNA链上有若干相同碱基时，会检测到电压加倍，通过优化酶聚合酶，如新推出的Hi-Q酶聚合反应非常快，产生的PH值变化的峰更高、更尖、更利于判读，提高判读Homoploymer区域的准确性 劣势：
    • 通量较低，仅适合用于小基因组和外显子验证等测序。

华大DNB

DNA片段扩增（纳米球DNB技术） 1. DNA片段两段加接头 2. 变性处理后分离得到单链DNA 3. 加入与接头序列互补的连接引物，使单链DNA成环，连接酶连接两个接头 4. 在聚合酶的作用下沿着引物进行连续不断的滚环扩增 5. 上百份拷贝都在一股新DNA上，形成一团DNA纳米球（DNB, DNA Nano Ball） DNA纳米球附着芯片 DNB纳米球经过装载技术固定在阵列化（Patterned Array）的硅芯片上，芯片每个位点的蛋白质自动附着上去一个DNB纳米球 测序 1. DNA分子锚和荧光探针在DNB上进行聚合 2. 高分辨率成像系统对光信号进行采集 3. 光信号经过数字化处理后即可获得待测序列 优势：

  • DNB通过增加待测DNA的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度
  • 不同于PCR的指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积
  • DNB与芯片上活化位点的大小相同，每个位点只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰
  • 阵列化测序芯片和DNB测序技术的结合，使得成像系统像素和测序芯片的面积得到最大化利用
  • 核心技术：DNB技术、Patterned array技术、cPAS技术

二代测序出现错误的原因

1. 信号积累与信噪比退化（生化层面）

Phasing 和 Pre-phasing 属于这一类。其本质是分子群落（Cluster）的非同步化。

  • Phasing (滞后)：化学反应不完全（末端修饰未脱落或未延伸），导致部分分子留在 n−1 步。

  • Pre-phasing (超前)：末端阻断失效，导致部分分子直接跳到 n+1 步。

  • 后果：随着循环数（Cycle）增加，噪声呈指数级积累。这就是为什么 Illumina 读长通常限制在 150-300bp 的物理瓶颈——到后面，“杂音”盖过了“主音”，Q30 质量值断崖式下跌。

个人理解：如果一个集群（Cluster）中有 10% 的分子发生了 Phasing（滞后），那么在第 10 轮成像时，这 10% 的分子发出的其实是第 9 轮的信号（$I_{n−1}​$）。测序软件（Basecaller）每一轮都会强行识别一个碱基。如果$I_{n−1}​$的背景噪声太强，导致识别错误，结果就是在该位点记下一个错误的碱基（替换错误），但不会改变总读长。

2. 空间重叠与集群密度（光学层面）

除了信号的时间同步问题，还有空间上的分辨问题。

  • Over-clustering（过饱和）：如果上机浓度（Loading concentration）过高，Flow Cell 上的集群会靠得太近。

  • 后果：光学镜头无法分辨两个相邻集群的荧光信号，导致坐标定位（Template Generation）失败或颜色串扰。这种错误通常发生在测序的最初几个循环。

  • Under-clustering（密度过低）：虽然错误率低，但数据产量极低，导致有效信息不足。

个人理解：

  1. 非模式芯片（non-patterned flow cell）中，DNA 片段随机结合在探针表面，如果浓度太高，扩增后的两个cluster可能在空间上发生物理重叠导致相机无法区分，信号被丢弃或识别错误。
  2. 而模式芯片（patterned flow cell），如NovaSeq，通过Exclusion Amplification（ExAmp）“排除扩增”确保一个孔只有一个cluster（一个孔只会被一个DNA片段填满），但浓度过高会导致不同DNA片段同时进入一个孔并开始扩增（co-occupancy），导致信号无法正确识别。
    3. 序列偏好性与系统性偏差（序列层面）

某些特定的 DNA 序列天生难以被准确测序，这与 Phasing 无关，而与生化动力学有关。

  • GC 含量偏好（GC Bias）：
    • 低 GC 或高 GC 区域：在集群扩增（Bridge PCR）过程中，这些区域的扩增效率极低，导致信号强度弱。
  • 同聚物（Homopolymers）：
    • 虽然 Illumina 对 AAAAA 这种序列比 454 或 Ion Torrent 系统更稳定，但在极长同聚物中，依然会因为聚合酶滑移（Polymerase Slippage）导致插入或缺失错误（Indel）。
  • G-quadruplex（G-四联体）：复杂的二级结构会物理性阻碍聚合酶的延伸。
4. 实验室引入的“人造”错误（样本准备层面）

这些错误在测序前就已经存在于文库中。

  • PCR 嵌合体（Chimeras）与错配：文库构建时的扩增步骤会引入碱基错配。平均而言，高保真酶的错误率约为 10−6，虽然低，但在深度测序中会被放大。

  • Index Hopping（标签漂移）：在 Patterned Flow Cell 上，游离的接头可能导致 A 样本的 Read 被错误地标记为 B 样本。 个人理解：文库构建过程中，接头（Adapter）是过量加入的。即使经过两轮磁珠纯化仍然会有极微量的游离接头或引物残留。上机后，flow cell存在已结合的单链，游离接头，游离样本，以及高活性的DNA聚合酶。游离的接头B以文库A为模板通过其互补的P5/P7延伸，最终导致本属于样本A的片段接上了B的barcode。

光信号转换为数字信号

测序仪记录的是图像光信号（tiff） 需要转换为cif location，再转为BCL（进行stats control filter），最后得到fastq

BCL：BaseCalL，二进制文件，包含了每个circles和tite的碱基信息和质量分数，是真正意义上的RawData，由仪器的实时分析软件（RTA）生成

目前主流的数据拆分软件是bcl2fastq和bcl-convert

Bcl2fastq为旧版本的数据拆分软件，拆分速度较慢，目前已不再更新

Bcl-convert具有算法上的优化，拆分速度快，资源消耗小

不同软件拆分出的fastq ID不同